由固体颗粒稳定的乳液被称为Pickering乳液。甲壳素是自然界中含量仅次于纤维素的可再生天然多糖，广泛存在于虾、蟹及其他甲壳类动物的外骨骼中，具有良好的生物相容性和生物可降解性。甲壳素还具有降血压、降血脂、改善肠胃功能、调节机体免疫等功效，能在保健食品领域发挥重要作用。此外，甲壳素分子链上含有大量的—OH和—NHCOCH3，具有良好的双亲性，易于改性。甲壳素纳米纤维（ChNFs）是由甲壳素制备得到的一维纳米材料，不仅有甲壳素的优良性质，还具有高的比表面积、结晶度和模量，是一种极具发展前景的食品级Pickering乳化剂。ChNFs和甲壳素纳米晶能有效稳定O/W型Pickering乳液。
武汉轻工大学食品科学与工程学院的董同珺、魏孔菊、丁贝贝*等将甲壳素进行纯化、部分脱乙酰化及羧甲基化处理后得到同时带有氨基和羧基的ChNFs，表征其结构并将其作为乳化剂应用于稳定Pickering乳液，结合流变学特性、激光共聚焦显微镜等对乳液稳定性进行评估，观察其贮藏稳定性及对pH值的适应能力。以期在食品和生物技术领域用于保护和递送生物活性物质，尤其是对pH值敏感的物质。
1 ChNFs和RE-ChNFs的形态表征
图1A分别为ChNFs和RE-ChNFs水分散液的原子力显微镜（AFM）图像，可以清楚地看到单个纳米甲壳素的纤维形态。不仅如此，新鲜制备及再分散的纳米甲壳素在水介质中分散良好，均没有出现聚集现象。利用图像处理软件分别对2 种纳米纤维的长度和宽度进行统计学分析，结果分别如图1B、C所示，再分散前后ChNFs的平均长度分别为271.2 nm和295.4 nm，平均直径分别为39.4 nm和44.5 nm，长径比分别约为6.9和6.7，较低的长径比也符合α-甲壳素“短胖”的形态。此外，在AFM图像中还观察到有少许较短的物质存在。与一些已经发表的研究结果不同的是，制备得到的ChNFs悬浮液及再分散悬浮液中纳米纤维的尺寸变化不大，这可能是由于在制备过程中超声处理时间较短，对甲壳素尺寸的影响不大，甚至可以忽略不计。图2A为再分散前后ChNFs水分散液在相同浓度下的外观。结果表明，当水分散液中甲壳素浓度相同时，新鲜制备的ChNFs与RE-ChNFs水分散液的透光性差别不大，即浊度相近。经干燥除去分散介质得到的ChNFs只要再通过简单的超声处理就可重新分散在水介质中，且与新鲜制备的样品相比，除去分散介质后再次分散的过程并不会对ChNFs的分散性产生影响，这主要是由于甲壳素在浓碱和羧甲基化试剂处理之后，大大削弱了分子内和分子间的氢键作用。
AFM和TEM结果（图2B）表明，利用氯乙酸处理DE-chitin能得到可再分散纳米甲壳素，并且，冷冻干燥除去水分散介质及再分散时超声处理的过程对纳米甲壳素的长度和宽度影响不大，说明再分散过程中的冷冻干燥和短暂的超声处理并不会影响甲壳素的形态。
图3A所示为新鲜制备和再分散ChNFs悬浮液的粒径分布，测量前用超纯水适当对悬浮液进行稀释处理，避免多散射现象的影响。结果表明，新鲜制备和再分散ChNFs悬浮液的粒径分布基本相同，说明再分散过程并未对甲壳素的形态造成太大影响。这与AFM和TEM所得到的结论一致。由图3B可知，ChNFs悬浮液在pH 7条件下的Zeta电位值为-（38.1±1.2）mV，其绝对值大于30，且多分散性指数（PDI）为0.380，证明粒径分布均匀。此外，由粒径分布强度可知，所制得ChNFs与RE-ChNFs悬浮液尺寸均比较均一，粒径范围较小，这与所测得较小的PDI值吻合。
2 ChNFs和RE-ChNFs的结构表征
通过FT-IR及XRD结果确定所制备ChNFs的化学和晶体结构。图4A为甲壳素原料、PU-chitin、DE-chitin及ChNFs的红外图像，图4B为1 800～1 000 cm-1范围内的放大图，可以看出，1 730 cm-1处附近出现一个小峰，此峰是羧基的特征峰，表明在甲壳素分子链上成功引入羧基。与甲壳素原料及PU-chitin的结果相同的是，ChNFs的酰胺I键在1 660 cm-1和1 621 cm-1处有双重吸收峰，说明实验中所用甲壳素的晶体结构为α-晶型，且其晶体结构在整个处理过程中未发生变化。
图5中XRD结果显示，4 种甲壳素样品均在9.4°、12.8°、19.3°、20.8°、23.4°及26.4°处出现衍射峰，分别对应α-甲壳素晶体中的（020）、（021）、（110）、（120）、（130）及（013）晶面，这与FT-IR谱图结果一致。同时FT-IR谱图及XRD结果表明，在ChNFs的制备过程中，其部分脱乙酰化和羧甲基化均只发生在ChNFs的表面。与未经处理的甲壳素相比，在甲壳素纯化、部分脱乙酰及羧甲基化的处理过程中，样品结晶峰的峰值均随处理过程的增加而逐渐降低，这也表明了甲壳素的分子间氢键在处理过程中进一步被破坏。
3 乳液的流变学特性
图6A为Pickering乳液的弹性模量（G′）和黏性模量（G″）随频率的变化趋势，可以看出，即使乳液中ChNFs含量在很低的情况下，3 个样品在低频区的G′均高于G″，表明这些乳液都表现出明显的凝胶特性，且当ChNFs质量分数大于1.0%时，所稳定乳液样品的G′、G″值在低频区不依赖于频率的变化。除此以外，ChNFs质量分数为1.0%和2.0%时，稳定的Pickering乳液G′、G″变化趋势与0.5%时的变化趋势略有不同，当用来稳定乳液的ChNFs质量分数较低（0.5%）时，G′和G″在较低频率条件下较低，在较高频率下相交，这一现象与Xu Baomei等研究结果类似，他们将这一现象归因于乳液中的物质很少或没有形成网络结构。随着稳定乳液的ChNFs质量分数的增大，乳液的G′和G″逐渐增大，当乳液中ChNFs质量分数为2.0%，乳液的G′和G″值分别约为22 Pa和3 Pa，此时G′值超过G″值7 倍以上，且在0.1～10 Hz的频率范围内相对保持不变，说明此时乳液中的物质形成凝胶状网络结构。图6B所示为Pickering乳液的黏度随剪切速率的变化趋势，可以看出，当剪切速率高于0.1 s-1时，3 种乳液样品均表现出典型的剪切稀化行为，即在低剪切速率下，乳液的剪切黏度都很高；随着剪切速率的不断增加，乳液的剪切黏度逐渐减小，这表明乳液网络可以被较高的剪切速率破坏，同时这一现象也证明所制备的乳液类型属于水包油型乳液。此外，乳液的表观黏度随ChNFs质量分数增加而增加，这可能是由于ChNFs悬浮液连续相的黏度增加导致。
4 乳液的微观结构
图7为ChNFs质量分数为1.0%时稳定的Pickering乳液的CLSM图像，其中油相用尼罗红染色，ChNFs用FITC染色，可以看出，在乳液中绿色的ChNFs几乎占据整个观察背景区域，呈连续相分布（图7B），而红色的石蜡呈现出相对独立的液滴状分布（图7A）。如图7C所示，在ChNFs的水连续相周围包围着独立分布的油滴，这一现象证实制备的乳液类型为O/W型乳液，也与乳液的流变学测试结果保持一致。
5 乳液的贮藏稳定性
由图8A可知，随着分散液中ChNFs质量分数的增大，ChNFs分散液的光散射增加，即浊度增加。图8B～F为不同质量分数ChNFs稳定的Pickering乳液在室温条件下贮藏0、7、14、28 d和90 d的外观图片。表1所示为不同乳液样品在贮藏期间的EI。这些结果表明，0.1%～2.0%的ChNFs在0 d（新鲜制备时）均能有效稳定Pickering乳液，且EI值无显著差异。此外，当用于稳定乳液的ChNFs质量分数较低时（0.1%、0.2%），样品在0～7 d的贮藏期内会出现明显分层，且在3 d乳液底部就可观察到少量分层并随着贮存时间的延长，分层现象逐渐明显。与之相反的是，当用于稳定乳液的ChNFs质量分数较高时（0.5%～2.0%），所制备的乳液在整个90 d的贮藏期内均不会出现明显分层，除0.5% ChNFs稳定的乳液在贮藏后期EI值略有降低外，其他2 个乳液样品的EI值均能维持在1左右，表明乳化效果良好，乳液具有优异的贮存稳定性，同时也证明制备的ChNFs具有作为乳化剂的潜力。
6 pH值对乳液稳定性的影响
通过部分脱乙酰化处理使得ChNFs表面带有一定量的氨基，再通过羧甲基化处理赋予其羧基，使ChNFs具有类似蛋白质的双电荷性质。利用2.0% ChNFs悬浮液在不同pH值条件下制备得到的石蜡-水乳液放置24 h后，研究pH值对乳液稳定性的影响，其中油水的体积比为1∶9。由图9可知，当乳液的pH值在3～11范围内时，24 h内ChNFs都可以稳定乳液，若进一步增大或减小乳液的pH值则会出现破乳现象。在较高或较低pH值时出现破乳现象的原因可能是此时纳米粒子电荷密度较高，导致排斥力增加，从而出现油水分层的现象。尽管如此，ChNFs依然具有在较大pH值范围内稳定乳液的能力，与传统具有pH值响应性的乳化剂相比，本实验制备得到的ChNFs还具备来源广、可再分散及生物相容性高的优点，应用前景可观。
7 结 论
利用脱乙酰化法结合羧甲基化处理，制得同时带有氨基和羧基的ChNFs，且其经干燥除去分散介质后仍能再次分散，便于大规模运输和贮存。此外，这种ChNFs能有效稳定O/W型Pickering乳液，结果表明所制得的Pickering乳液具有良好的凝胶特性，同时还具有良好的贮藏稳定性及较宽范围pH值适应性，可以用于保护和递送对pH值敏感的活性物质，拓展了甲壳素在食品生物领域的应用。本文《可再分散甲壳素纳米纤维的制备及其在稳定Pickering乳液中的应用》来源于《食品科学》2023年44卷24期1-8页. 作者：董同珺，魏孔菊，双 媛，丁贝贝，王学东，丁文平. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230221-193. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。